跨越物种的相遇之路，这些“铺路人”值得被铭记 | 微生物“智”造
以下文章来源于科学大院 ，作者李辉
转载自：科学大院（ID:kexuedayuan）
作者：李辉 吕雪峰（中国科学院青岛生物能源与过程研究所 微生物制造工程中心）
在生命科学还未曾兴起的时代，人类对跨物种生命体的想象只停留在麒麟、美人鱼这类形象。如今，随着科学技术的发展，物种间界限的突破不再是天方夜谭，组合物种的功能也不再是遥不可及的事情。
经过改造，微生物能拥有来源于动物、植物等生命体的能力
（图片来源：Wikipedia及Veer图库）
想要将一个物种的功能在另一个物种中完美呈现，把来源于不同物种，代表不同功能的DNA组装起来是实现最终目标的第一步。实现这个过程的技术叫做“DNA组装”的技术，它从无到有，从繁至简的过程离不开一群才华卓越的科学家和生物工程师。
历经半个多世纪，“DNA组装”的玩法趋于丰富。从场所来分，“DNA组装”可以分成体内和体外两种，我们首先来了解下体外组装技术创造者背后的故事。
游戏和玩法的缔造者
在第一种DNA组装技术诞生之前，如果说生命体是大自然天衣无缝的作品，那么第一种DNA组装技术的诞生便赋予了生物工程师“上帝视角”和部分“造物”能力——“上帝视角”让生命体的生物学功能在工程师眼中变成可供组装的模块，“造物”能力则赋予工程师组装模块的能力。由此，生命体的表型形式也随着人类的想象力打开了新的图景。
1973年，物种间边界第一次被打破。在这一被视为遗传工程的开山之作中，斯坦福大学的斯坦利·诺曼·科恩（Stanley Norman Cohen）教授和加州大学旧金山分校的赫伯特·韦恩·博耶（Herbert Wayne Boyer）教授是最关键的两位生物工程师。他们的石破天惊之举，是首次在体外将一个生命体的DNA片段和一个质粒连接起来，在形成重组质粒之后，将其转到另一个生命体。此时，原生命体DNA所代表的生物学功能得到完美的复制。
斯坦利·诺曼·科恩（左）和赫伯特·韦恩·博耶（右）
（图片来源：维基百科）
这种在现在看来可能平平无奇的DNA组装技术就是酶切连接，在技术中发挥关键作用的主要是限制性内切酶和DNA连接酶。（是不是唤醒你沉睡的高中记忆？）限制性内切酶就像剪刀，能识别并切割特定DNA序列，且在切割不同来源DNA后，其留下来的缺口一致。这样，不同切割产物上形成的切口就可以通过碱基互补配对跟彼此粘连在一起。
那DNA连接酶能发挥什么作用呢？DNA连接酶如同胶水一般，可以将两个片段间的缺口连起来，形成完整的DNA双链。虽然DNA识别位点的特异性对这种技术造成了限制，但截至目前，超过800种已经商业化的限制性内切酶还是极大增加了工程师的选择。
酶切连接（图片来源：Khan Academy）
尊重创造的制度及文化氛围从不亏待那些聪明绝顶的想法，与革命性技术相匹配的应当是缔造者的名利双收。因为这项技术的发明，两位发明人以及他们所属的机构获得了丰厚的回报，在申请3项专利之后，曾有超过470家公司有偿使用过它们，专利本身也影响了数千种产品的开发。功不唐捐，两人共同分享了包括“拉斯克基础医学研究奖”“国家技术奖章”“邵逸夫奖”等众多分量十足的奖项。
宏大的目标催生出卓越的技术
在生物技术的图谱中，有些技术的诞生是水到渠成。当基础研究的成果积累到一定程度时，一个神来之笔便会促进新技术的蓬勃发展，2020年获得诺贝尔化学奖的CRISPR基因编辑便属于此类。但还有一些技术的发明，是由宏大的目标所催生的。
人工合成细胞是21世纪之初的一个宏愿，这个项目的共同领导人是汉密尔顿·史密斯（Hamilton O Smith）、克莱德·哈奇森（Clyde A Hutchison III）和克雷格·文特（J Craig Venter）教授。人工合成一个583kb（kb即kilobase，千碱基对）的支原体基因组则是他们所面对的一个具体的挑战，这个挑战最终催生的技术叫做吉布森组装（也叫Gibson组装，Gibson是这个技术主要发明人Daniel G Gibson的姓）。
丹尼尔·吉布森，克雷格·文特，克莱德·哈奇森，汉密尔顿·史密斯（图片来源：The J. Craig Venter Institute）
在常规的酶切连接中，不同片段之间的连接依赖的是片段之间一致的酶切位点，这对于目标长度较小、应用较为简单的DNA组装任务基本够用。但是，在面对目标产物较长，较为复杂的DNA组装任务时，限制性内切酶的有限性及酶切位点的特异性使得这种方法显得无能为力。
Gibson组装摆脱了酶切连接的限制，基本能做到“包打天下”——任意两个DNA片段，只要末端有一定长度重叠的序列，两个片段就可以被组装起来。此外，其能组装起来的DNA也远大于酶切连接组装起来的DNA序列。
在Gibson组装中，出力的主要是三种酶：T5核酸外切酶、高保真DNA聚合酶与Taq连接酶。首先是T5核酸外切酶，它能从DNA的5’到3’端逐个切除碱基，使DNA的末端变成单链。由于两个需要组装的DNA片段之间有重叠，所以两个末端的单链又能通过碱基互补配对连接起来。此时的连接产物仍不完整，缺乏的碱基会由高保真的DNA聚合酶补上，两个片段之间最后的间隔则由连接酶来连接。
经由这一过程，他们最初开发这个技术的目标得到实现，甚至900kb左右乃至更高千碱基对的DNA片段也可以用这种技术组装起来。
Gibson组装（图片来源：翻译自Daniel G Gibson et al., 2009）注：红色和绿色代表不同的DNA片段，黑色代表两个片段间一致的序列
鉴于Gibson 组装的高效、普适，以及其在大片段DNA组装能力方面的一骑绝尘，被开发出来之后，它很快地受到了科学界和工业界的广泛关注和认可。一个典型的表现是，2009年开发此技术的文章目前已经被学术界的同行引用超过6000次。另外，基于Gibson 组装的试剂盒以及可以自动组装DNA的仪器都已被制造出来，成为一种商品，Gibson组装也成为目前主流的DNA组装方法之一。其得到普及的一大重要原因是，改进后的Gibson组装技术，还能帮着省钱。
拯救你的“囊中羞涩”
尽管从能实现的组装任务上来看，Gibson组装基本上可以算得上一种终极的解决方案了。但是从部分使用者的角度出发，这一技术却有一个不好意思说的缺点——价格太贵。购买商业化的试剂盒，进行一次DNA组装，平均下来就要100来块钱。用的次数少还好，如果需要组装的DNA过多，那么对于一些经费捉襟见肘的实验室而言，便是不可忽视的压力。
Gibson使用了3个酶，为了给同行省钱，也为了在DNA组装的市场里分一杯羹，不少生物工程师在减少酶的种类上花了不少心思。比如，一些只使用一个酶的DNA组装技术已经被开发出来了。其中最便宜的一种是由中国学者所开发的，这种方法叫做T5核酸外切酶依赖的组装（TEDA:The T5 exonuclease-dependent assembly）。顾名思义，在这种“玩法”中，扮演最为关键角色的酶是T5核酸外切酶。
T5核酸外切酶依赖的组装（Yongzhen Xia et al., 2018）
TEDA组装同样需要被组装的DNA片段末端存在15bp（bp即base pair，碱基对）以上的重叠区域，步骤总共分为三步。前两步和Gibson组装一致，都是通过T5核酸外切酶的切割以及片段间的自配对形成一个不完整的中间体。
区别在于第三步，在这个方法中，中间体直接被转到大肠杆菌体内，由大肠杆菌代劳，把缺口补上连接好，承担省钱的重任。
除以上三种比较有代表性的、涉及到体外的DNA组装技术，还有两种可以直接在微生物体内组装DNA的技术同样值得说道。
死对头的精诚合作
第一种影响力比较大的体内组装技术叫做RecET重组技术，这种技术的发明和推广和一位中国学者有着非常密切的关联，现山东大学的张友明教授和他曾经的博士后合作导师弗朗西斯·斯图尔特（A. Francis Stewart）是该技术主要的共同发明人。
张友明和弗朗西斯·斯图尔特（China daily 和Francis Stewart group）
这也是一种原理看起来极致简洁的DNA组装技术，其主要基于大肠杆菌E.coil进行开发的。它的特点是能利用一个线性化的载体捕获几乎任何类型的DNA，不管捕获的对象是DNA片段、质粒还是E.coil的基因组，只要线性化的载体两端和要捕获DNA两端有一致的序列，把它们一起转到E.coil中，它们基本就可以被组装起来。
RecET重组示意图
（图片来源：Youming Zhang et al., 2000）
当然，这种E.coil不是一般的E.coil。它的特殊之处在于，它是从“死对头”噬菌体借用了三个关键的蛋白：最初来自噬菌体的RecE(5’-3’核酸外切酶)、RecT(单链DNA结合蛋白)还有Redγ(一个抑制线性DNA片段被降解的蛋白)。
实际上，将病毒来源基因或者酶应用到生物技术的开发上，RecET重组并不是孤例，生物学家的工具包里还有很多工具同样都是病毒的馈赠。（而这些故事，我们则留至后续的文章中再细细道来）
所有重要的生物技术，都具有巨大的商业价值。RecET重组技术的历程再次证明了这一点。在该技术诞生两年之后，为拓宽该项技术的应用，作为发明人之一的张友明教授便作为首席科技官创建了一个生物技术公司。再之后，他和他曾经的博士后合作导师双双当选为欧洲科学院院士。
在组装DNA方面，酵母菌出道即巅峰
有一句俗语叫“林子大了什么鸟都有”，对于种类庞大的微生物世界而言，这句话更是贴切。在组装DNA这个方面，有些微生物本身的能力十分出众，堪称“出道即巅峰”，例如目前同源重组能力最为出色的酵母菌。
在酵母菌中进行DNA组装的要求很简单：只要两段DNA之间有一定重叠的部分，酵母菌就可以利用它的能力将这两个片段给连起来。2008年的一项实验可算是对其同源重组能力最好的例证。
这项工作还是曾经人工合成支原体基因组的团队所做的，令人瞩目的是，他们将25个两两重叠、大小在17~35kb之间的DNA片段全部转到酵母中，而酵母能一次性将这些片段连接成完整的基因组。
在酵母中组装支原体的基因组（Gibson D G et al., 2008）
经过了几十年的发展，目前生物工程师们已经具有了很强的将不同来源DNA组装起来的能力。除解决实际问题之外，新技术的开发和迭代还能加速人类想象力边界的拓宽。
那么，不妨也发挥一下你的想象：假如你现在拥有了组装不同物种来源DNA的能力，对于跨越物种边界的生命体，你有什么样的奇思妙想和忧心之处？不妨在评论区告诉我们，我们会给你想法的可行性把把脉，解答你的疑惑和担心。
参考文献：
[1] Cohen S N, Chang A C Y, Boyer H W, et al. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1973, 70(11): 3240-3244.
[2] 克雷格 文特尔，生命的未来，浙江人民出版社，2016
[3] Gibson D G, Benders G A, Andrews-Pfannkoch C, et al. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a Mycoplasma genitalium genome[J]. science, 2008, 319(5867): 1215-1220.
[4] Gibson D G, Young L, Chuang R Y, et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases[J]. Nature methods, 2009, 6(5): 343-345.
[5] Xia Y, Li K, Li J, et al. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis[J]. Nucleic acids research, 2019, 47(3): e15-e15.
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[7] Zhang Y, Muyrers J P P, Testa G, et al. DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli[J]. Nature biotechnology, 2000, 18(12): 1314-1317.
[8] Gibson D G, Benders G A, Axelrod K C, et al. One-step assembly in yeast of 25 overlapping DNA fragments to form a complete synthetic Mycoplasma genitalium genome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008, 105(51): 20404-20409.
策划：李辉 吕雪峰
作者单位：中国科学院青岛生物能源与过程研究所 微生物制造工程中心
